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吻鮈属(rhinogobio)鱼类物种分化的分析

发布日期:2022-08-04 09:38   来源:未知   阅读:

  。羹z客硕士学位论文2.对65尾吻鲷、42尾圆筒吻绚和72尾长鳍吻绚的13个计数性状和24个 比例性状作了主成分分析和聚类分析,并对部分性状作簇状条形图,以探讨吻约 属鱼类形态差异及特征演化: i本研究理清了吻绚、圆筒吻约和长鳍吻鲷的性状差异。侧线上鳞、侧线下 鳞和背鳍长/头长是区分长鳍吻胸同吻绚、圆筒吻绚的最有效性状。尾柄高/体长 以及眼径/体长是区分吻绚同圆筒吻觞的最有效性状。长鳍吻绚的侧线;圆筒吻绚的侧线;吻约的侧线。长鳍吻 约的侧线;圆筒吻约的侧线;吻绚的侧线。长鳍吻约的背鳍长/头长均大于1,而吻绚和圆筒吻绚的背鳍长均小于 头长。吻觞的尾柄高/体长的范围在0.065-0.080之间,平均0.0710.003;而圆 筒吻绚的尾柄高/体长在0.081-0.096之间,平均0.0870.003。吻J绚的眼径/体 长在0.039一O.056之间,平均0.046__.0.003;而圆筒吻鲍的眼径/体长在0.026— 0.035之间,平均0.0310.002。 ii吻绚属鱼类有如下的形态演化趋势:侧线鳞数目增多;侧线上鳞、侧线下 鳞、背鳍前鳞和胸鳍分支鳍条数目减少;身体渐趋于圆柱状;尾柄高和体高渐变 窄:眼睛渐变大;吻渐变长;背鳍、胸鳍、腹鳍和臀鳍渐变短;背鳍基和臀鳍基 渐变窄;肛门位置渐前移。 iii吻绚、圆筒吻约和长鳍吻胸的形态分化是对环境适应进化的结果。长鳍 吻绚更为强大的鳍、更强壮的尾柄和较小的眼径及较短的吻部是其对急流生活的 适应。而吻觞和圆筒吻胸的形态特征适应于流速较缓而清澈的河道。 iv形态分析支持遗传分析得出的关于三物种物种分化的结果。 关键词:吻晌属;物种分化;系统发育;渐渗杂交 of只季硕}:学位论文Speciation offish genusRhinogobio ABSTRACT Rhinogobioan endemic genus Gobioninae,Cyprinidae,Cypriniformes;which consistsof5 species:R.typusBleeker,R.cylindricusGiinther R.ventralis Sauvage et Dairy足hunanensisTangand足nasutus(Kessler).By using speciesR.typusBleeker.R.cylindricusGfintherand足ventralis Sauvage et Darbry asthe subjects,thepersentstudy aimstoinvestigatespeciation ofthis genus. The followings arethemainconclusions. 1.The studyinvestigatesphylogenyspeciation RhinogobiobyusingCytbgene andintronI ofS7ribosomal proteingene asthe molecularmarkers: 260Cyt fromR.typus,72 from R.cylindricus and107 from R.ventralis)and 36 sequences ofintronIofS7ribosomal proteingene(1 0from R.typus,1 4fromR.cylindricus and12from R.ventralis)were obtained.Two samples ofR.cylindricus sharecommon haplotyes suggestedthatthetwo samples R.cylindricusshouldbethe offsprings ofR.typus R.cylindricusastheresultof introgressivehybridization. ii The phylogeneticrelationship constructedusingneighbor-joining method basedon Cyt geneandintronI ofS7ribosomal proteingene.R.typus andR. cylindricus aremore closely relatedtoeachotherthantoR.ventralis.R.ventralisis moredistal—relatedtotheothertwo species. iii R.ventralisandtheancestorofR.Opusand R.cylindricus differentiatedin lateMioceneabout6.19million yearsago,and havebecome perfectlyreproductively isolatedfrom R.typus R.cylindricus.iv R.typus R.cylindricusdifferentiatedinlatePlioceneabout2.285million yearsago.R.typus definitely‘goodspecies’atpresent,buttheystill introgressivelyhybridized somedegree.Theirintrogressivehybridizationconsistsoftheleakage oftheallelesfrom R.typusgenepool R.typus,R.cylindricusandR.ventralis experiencedpopulationexpansion 厶支只鬈硕士学位论文about87084,42304and48560 generationsagorespeetivdy. 2.Thirteenmeristiccharactersand24measurablecharacteristicsof179 samples (65from足typus,42from足cylindricus and72 from足ventralis)wereanalyzed morphologicaldifferencesandcharacterevolutionof species Rhinogobio,usingthemethodsof principalcomponentanalysis,clusteranalysis makingclusteredbarcharts: Themorphologicaldifferences amongR,typus。R.cylindricus andR.ventralis specifiedperspicuously.Themost distinguishable charactersofR.ventralisarethe numberofscalesabovethelaterallinescalesbelowthelaterallineandtheratioof dorsalfin length tohead length。Theratioofcaudal depth bodylengthandtheratio eyediameterto bodylength arethemosteffectivecharactersto distinguishR.typus R.qti埘nals.Thenumberofscalesabovethelateralline ranges from7.0to8.5 witllan average of7.254-0.40in R.ventralis;The numberofscalesabovethelateral lineinR.OpusandR.cyfindricusboth ranges from6.0 to7.0 withan average 6.03士0.16and6.03+0.16respectively.The numberofscalesbelowthelateralline ranges from6.0to8.0witllan average of6.42+0.48 in足ventralis;the numberof scalesbelowthelateralline ranges from5.0to6.0withan average of5.264-0.30inR. cyfindricus;and R.Opus,thenumberofscalesbelowthelateralline ranges from 4.0to5.5withan average of4.68+0.39.Theratioofdorsalfin length tohead length R.ventralis;butinR.typus R.cylindricus,theratioisbelow1.The ratioofcaudal depth bodylengthin尼typusrangesfrom0.065to0.080withan average of0.071+0.003;butin尼cylindricus,theratio ranges from0.081 to0.096 withall average ofO.0874-_0.003.Theratioof eye diameterto bodylength R.typusranges from0.039to0.056withan average R.cylindricus,theratio ranges from0.026to0.035withan average of0.031O.002. iiThereis anevolutionary trendinthe genusRhinogobio towardsmorelateral line scales,less scalesaboveandbelowthelaterallinelesspredorsalscales,less ramose pectoral fin rays,a morecolumned bodyfigurea lower body andcaudal depth,largereyes,alongersnout,shorterfins,narrower dorsalandanalfinbase lengthandamoreanterioranus. of只季硕十学位论文iii Thediffcrc—ntiation morphologicalcharactersis theresultof adaption evolution.R.ventraliswith stronger caudal peduncal fins,smallereyesanda shortersnoutis adapted fast.flowingtuibidriversand R.Opus slow—flowingclearhabitats. ivThe morphological results support theconclusionsofmolecular analysis about speciationofthe genusRhinogobio. KeyWords:Rhinogobio;speciation;phylogeneticrelationship;introgressive hybridization of只客硕士学位论文第一部分前言 第一章物种与物种分化 1物种概念 关于物种的概念,不同时期、不同学者有着不同的见解。Mayr回顾了1980 年前提出的种种有关物种的概念【l捌。之后20年来,有关物种概念的争议进一步 加剧,新的物种概念不断提出【3】;但目前应用最广的是生物学物种概念(Biological SpeciesConcept,BSC)。 根据形态学标准,物种被定义为“形态相似的个体的集合”;根据遗传学标 准,物种被定义为“交互繁殖的群体,共有一个基因库"【41。有学者提出了基因 型群体物种概念(Genotypic Cluster SpeciesConcept,GCSC),认为物种是一个在 形态上或遗传上可明显辨识的类群,同其他这类类群接触时不产生或很少产生中 间个体【51。生态学物种概念(EcologicalSpeciesConcept,EcSC)认为物种是生态 系统的功能单位,每个物种在生态系统中占一个生态位,处于它所能达到的最大 适应状态;物种就是在适应场上占据一个适应峰的谱系或谱系组合;一个物种若 发生种内分异,占据多个生态位,就是物种分化的过程【61。进化物种概念 (EvolutionarySpeciesConcept,EvSC)认为物种是由同一祖先演化来的后代种群 或个体组成的谱系,同其他这类谱系相比,保持着明显的自身特征,具有自己独 立的进化趋势f7,8】。系统发生物种概念(PhylogeneticSpeciesConcept,PSC)认为 物种是最小的完整的有着共同祖先的单系群19】。定义较为简明而应用又较为方便 的物种概念要数生物学物种概念(BiologicalSpeciesConcept,BSC):“物种是由 种群组成的生殖单元,和其他单元存在生殖隔离,它在生境中占一定的生境地 位”;陈世骧补充上“在宗谱线上代表一定分支”,使得生物学物种概念成为包 含种群组成、生殖隔离、生态地位和宗谱分支四方面内容的较为完整的物种定义 [1011】。生物学物种概念强调整个基因组的生殖隔离;随着分子生物学研究的深入, Wu对生物学物种概念做了重要修订,在基因水平上提出了物种概念,认为物种 是分化适应的群体,物种间即便接触也不可能通过直接的基因交流或中间杂交种 群而共享控制适应性状的基斟121。 厶t只互硕士学位论文2物种分化过程 2.1渐进式物种形成和量子式物种形成 根据物种形成所需要的时间和中间阶段的有无,可分为渐进式的物种形成 (gradualspeciation)和量子式的物种形成(quantumspeciation)[413】。 渐进式的物种形成是在物种分布区内,先由外界物理因素起着阻止种群间基 因交流的作用,从而促进种群间遗传差异逐渐地、缓慢地增长,通过若干中间阶 段,最后达到种群间完全的生殖隔离和形成新种。环境隔离因素是渐进种形成的 必要条件,它的渐进发展可能与被分隔的种群间遗传差异的积累是并行的过程。 量子式物种形成是种群内一部分(往往是少数)个体,因遗传机制或(和) 随机因素(如显著的突变,遗传漂变等)而相对快速地获得生殖隔离,并形成新 种的过程,又称为骤变式物种形成(sudden speciation)。量子式的物种形成可能 通过遗传系统中的特殊的遗传机制(例如转座子在同种或异种个体之间的转移), 通过个体发育调控基因的突变,通过染色体重组和减数分裂等途径而实现。 2.2异域物种形成、邻域物种形成和同域物种形成 根据物种形成的地理特性,可分为异域物种形成(allopatricspeciation)、邻 域物种形成(parapatricspeciation)和同域物种形成(sympatricspeciation)【4’1 31。 异域物种形成指两个初始种群在新种形成前其地理分布区是完全隔开、互不 重叠的。异域式物种形成过程是:最初由祖先种,一般是一个广布种,在其分布 区内,因地理的或其他隔离因素而被分隔为若干相互隔离的种群,分布区在不同 的地理区域内。这些被隔离的种群间的基因交流大大减少或完全中断;随后,由 于环境条件的差异,经过自然选择产生不同的适应,基因和基因频率定向地发生 变化,形成了不同的亚种。亚种之间的性状分歧发展到隔离后再相遇已不能有基 因交流时便产生生殖隔离并导致物种形成。 邻域型物种形成指初始种群的地理分布相邻接,种群间个体在邻接地带存在 一定程度的基因流动,但并不影响两个种群的分化和独立存在。这种物种分化方 式常发生在一些分布区很广但扩散能力较差的物种的分布区边缘,分布区边缘的 小种群由于栖息地环境的差别而形成基因交流的阻碍,逐渐建立起自己独特的基 因库,并形成生殖隔离,最终形成了新的物种。邻域型物种形成与异域形成方式 有以下区别:一是不需要出现地理上的隔离;二是这些种类的活动能力往往极弱, 厶f片客硕十学位论文由于活动能力微弱而选择力量很强,因此分布区交界处的少量基因流动不足以防 碍两个类型的独立存在;三是遗传性质发生了变化的个体在自然选择的作用下产 生了生殖上的隔离机制,所以不需要出现地理隔离也可完成物种形成的过程。 同域物种形成指在两个种的形成过程中,初始种群的地理分布区相重叠,形 成新种的个体与原种其他个体分布在同一地域。由于资源的限制和种群内部的激 烈竞争,导致生态位出现分化,一般生态、行为上的歧化选择可形成所谓生态或 行为隔离,使分布在同一区域的群体出现基因交流的障碍,通过生殖隔离形成新 的物种。 2.3物种形成过程在分子水平上的描述 Wu认为物种形成是对不同自然环境或性选择的分化适应,生殖隔离是这种 分化适应的副产物‘12】。物种分化过程中,控制适应性分化的基因(genes differentialadaption)只是基因组一小部分;物种分化全过程最初取决于这类基 因,称成种基因(speciationgenes)。物种分化在基因水平上可人为地分4个阶段。 阶段I:种群分化发生在少数起着功能分异(functionaldivergence)作用的基因 位点。二次接触中,基因交流广泛,但在这些起着功能分异作用的基因位点上, 基因交换被限制。二者这时为同一物种的两个不同种群。阶段II:两种群间基因 分化加剧。种群内部的基因替代具有生理上的意义。两群体间杂交产生的基因型 组合往往使杂种不适于生存或不育。这一阶段中,绝大部分基因组未分化,常用 “亚种”地位以反映其分类地位的不明确;不能确定两群体是继续分化,还是会 发生融合产生杂种型。阶段III:两分化群体的基因库已不可能再融合。同域分 布的物种要么共存要么经历竞争排斥;异域分布的物种会形成一狭窄的杂交区。 成种基因的积累使两群体至少在繁殖生物学、性行为和/或形态上产生一定分化, 两群体是有效物种。但是通过渐渗杂交,两物种的基因共享还会持续很长一段时 间。阶段Iv:两物种实现了完全的生殖隔离。 3分子系统学和物种分化研究 20世纪60年代,Henning创立了系统发育系统学(Phylogeneticsystematics), 又叫分支系统学(Cladistics),以研究各分类单元间的亲缘关系即系统发育关系 31。系统发育学家曾采用表型形态性状、骨骼解剖性状和化石记录等作为分析 研究的依据。但是形态特征常常有趋同进化等问题,化石记录又相对不完整,这 。薹只霉硕士学位论文就限制了系统发育系统学的深入发展。随着分子生物学的诞生及发展,其相关方 法和技术被应用于系统发育系统学,于是产生了一门新的学科——分子系统学 (Molecularphylogenetics)。分子系统学就是应用分子生物学的技术和方法,通 过对生物大分子的结构、功能等的进化研究,来探讨生物多样性以及生物间相互 关系的科学。它主要包括两大领域,即种群遗传学(Populationgenetics)和系统 发育学(Phylogenetics),前者主要研究种内分化,后者主要研究物种多样性及 种间系统发生【141。分子系统学在分子水平上较传统的系统发育系统学更能本质 地反映系统发育关系。形态和解剖结构性状和分子性状间是表型和基因型的关 系。分子手段使系统发育直接深入到进化的载体上,跨越了表型和基因型的鸿沟, 使系统发育排除了造成错误的主观因素,由此得出的基因树比其他性状树更有说 Arise用分子系统学的方法研究物种分化过程,认为基因树的分化早于物种树的分化;一对姐妹群从共同的祖先种群起始分化后,在不同的时间尺度上,二 者的相互关系经历了由复系到并系最后到单系的演变,如图l所示【15】。祖先种 群11代时内部出现了基因交流障碍,分化出了A祖种群和B祖种群。A祖种群 和B祖种群分化初都各保留了两个分化支,此阶段中A祖种群和B祖种群呈复 系关系。随后A祖种群的两个分支发生基因交流,交流后形成的两分支都延续 了下来;但B祖种群的两个分支发生基因交流后,一个分支被淘汰,使B祖种 群成为一个单系群,A祖种群和B祖种群此阶段呈并系关系(Aparaphyletie respecttoB)。随着进化的进行,A祖种群的两个分支中的一个被淘汰,另一支 分化出许多新的分支,成为今天的A种群;B祖种群的那个分支又分化出许多 分支,构成了今天的B种群;A种群和B种群分别构成单系。 10 。茹鼻玺硕I:学位论文 4030 20 10 、r1—’J————。——‘———吖.【prior histOry 图l(引自Avise,2000)两姐妹群在物种分化过程中不同时间尺度上的系统发育关系Fig.1(FromAvise.2000)111ephylogeneticrelationshipoftwosister groups atvarioustime depthsduring processofspeciation 第二章吻夤甸属鱼类的研究概况及物种分化问题 1吻惫甸属鱼类的研究概况 吻觞属(Rhinogobio)隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)绚 亚科(Gobioninae),为中国的特有属【16】。吻绚属是由Bleeker于1871年以吻觞 (Rhinogobiotypus)为模式种建立的【17】。Banarescu和Nalbantl973年总结了吻 胸属的四个有效种:吻觞(R.typusBleeker)、圆筒吻觞(月.cylindricusGUnther)、 长鳍吻觞(R.ventralisSauvage et Darbry)和大鼻吻绚(R.nasutus(Kessler))It8】。 乐佩琦1998年又将湖南吻晌(R.hunanensis Tang)列入吻觞属【19删。至此,吻 从80年代以来直到现在,零零散散地出现了一些有关吻晌、圆筒吻觞和长鳍吻觞生物学特性的研究报道【2卜261。近年来又有学者开始对吻绚、圆筒吻购和 长鳍吻觞的器官组织做初步研究【27’281。但是有关吻绚属鱼类系统发育和物种分化 研co;毋..oco翻一叮P亡一c功.10 。董只季硕士学位论文 的研究报道比较少。吻绚属于1971年建立后,B百n百res;cuNalbantl973年研究认为圆筒吻约、长鳍吻钩和大鼻吻约相互间的亲缘关系比吻约更为接近;吻胸具 有更多的衍生性状f131。20世纪80年代,洪云汉分析吻鲍、圆筒吻约和长鳍吻鲷 的核型,结果三种鱼的核型完全一致,为2n=14m+22sm+12st+2t,NF=8[29'301。 1997年陈定福对吻绚和圆筒吻绚的8种同工酶进行电泳分析,7种在两种鱼6 种组积中的酶带表型基本相同,基因数一致,表现出明显的遗传相似性,与两种 鱼的形态特征和生物学特性的相似性相吻合,表明吻绚和圆筒吻约亲缘关系十分 密切p。2005年,WangLiu研究了吻绚、圆筒吻绚、湖南吻绚和长鳍吻蠹句的 线粒体DNA控制区序列及形态特征,认为圆筒吻绚、湖南吻绚和吻绚具有更近 的亲缘关系;吻鲍属鱼类的形态有体变细长、背鳍变短、口角须变短和眼睛变大 的进化趋势【321。 大鼻吻绚只分布于黄河水系,湖南吻约分布于湖南沅水中上游。由于大鼻吻 觞和湖南吻胸采样困难,本实验拟以吻约、圆筒吻绚和长鳍吻购为研究对象。 吻绚,地方名有秋子、长鼻白杨鱼、大鼓眼、铁杆鳅,秋子和鳅儿棒等,是 一种中小型鱼类,分布于长江中上流和闽江水系,主要以底栖无脊椎动物为食, 也食藻类和有机碎屑,生长速度慢。吻约2—3龄可达性成熟,生殖期在3—4 月份【20如州。 圆筒吻绚地方名叫尖脑壳、尖尖鱼、尖尖嘴等,为底栖性鱼类,分布于长江 中上游及岷江、嘉陵江、沱江及乌江等支流。圆筒吻鲷的主要摄食底栖无脊椎动 物,如摇蚊幼虫等水生昆虫或藻类,生长速度较慢[2033341。 长鳍吻绚地方名为土耗儿等,是一种小型鱼类,分布于长江中上游及其主要 支流的干流。长鳍吻觞喜生活于河流底层,主要食物为淡水壳菜(Limnoperna fortunei)、河蚬(Corbiculafluminea)、蜻蜒目(Odonata)和鞘翅目(Coleoptera) 的幼虫及其它水生昆虫等,生长速度较慢。其繁殖在3—4月份‘20,33'341。 2吻鲍属鱼类的物种分化问题 在吻约属鱼类的亲缘关系上,B百哟rescuNalbant的观点同Wang&Liu的研 究存在分歧;野外调查中发现有些属于吻绚属的鱼类从外部形态上较难区分其是 吻绚还是圆筒吻绚;这引发了我们对吻绚属鱼类物种分化的思考。本研究比较吻 约、圆筒吻绚和长鳍吻绚线核糖体蛋白基因内含子l序列 12 。羹Z季硕L学位论文 的差异,深入探讨它们的遗传分化及系统发育关系;同时辅以吻绚属鱼类形态特 征的研究,筛选出吻绚属鱼类存在差异的形态性状,探讨其形态分化。将遗传分 析的结果同吻绚属鱼类形态特征及生态环境结合,可以探究吻绚属物种分化的阶 段与机制以及杂交渐渗等问题。 第二部分吻绚属鱼类物种差异与分化 吻|萱句属是中国的特有属,其中圆筒吻胸和长鳍吻绚是长江中、上游的特有鱼 类;二者和吻觞同是长江主要的经济鱼类。本研究以线粒体细胞色素b基因和 S7核糖体蛋白基因内含子l序列为分子标记,深入探讨它们的遗传分化及系统 发育关系,有助于吻绚属鱼类的鉴定和亲缘关系的确定。同时,期望筛选出吻绚 属鱼类存在差异的形态性状,探讨其形态分化。将遗传分化和形态分化结合,探 究吻筋属物种分化问题,也为吻觞属鱼类资源的合理保护提供基础参考资料。物 种分化是生物学研究的热门领域,本研究研究吻绚属鱼类分化的实例,进而探讨 物种分化的地理、形态、生态和繁殖隔离以及分化阶段和机制等问题,寻求物种 分化的普遍规律。另外,物种分化是维持生物多样性的保证;探讨吻觞属鱼类的 物种分化能加深我们对于生物多样性的理解。 第三章吻童甸属鱼类分子系统发育、物种分化过程及种群动态历 史分析 1材料 所研究的吻胸、圆筒吻觞和长鳍吻晌采自攀枝花、宜宾、合江、木洞、万州、 小南海、宜昌的长江干流江段以及武汉和赤水河。除宜昌和武汉的样本外,其他 各地样本皆按以下方法采集:每一尾样本,剪其右侧胸鳍和腹鳍以及右侧背部肌 肉保存于酒精(用做遗传分析);将剩余鱼体系标签保存于5—7%的(用 于形态分析);将该鱼标签号记于硫酸纸标记该鱼的鳍条和肌肉,以使该鱼和从 该鱼所取的鳍条及肌肉对应。宜昌和武汉的样本直接保存于酒精。标本鉴定按照 乐佩琦等的检索系统【201。 用于线粒体细胞色素b序列分析的样本共260尾(表1)。对以上260尾样 本中的36尾作了S7核糖体蛋白基因内含子l序列分析(表2)。 .厶主另客硕士学位论文表1用于线粒体细胞色素b序列分析的样本 Tab.1 Samples fortheanalysisofCytb sequences 表2用于S7核糖体蛋白基因内含子1序列分析的样本 Tab.2 Samples forthe analysis ofintronIof¥7 gene 2方法 2.1分子标记的选择 本实验选取线粒体细胞色素b基因序列和S7核糖体蛋白基因内含子1序列 作为研究吻绚属系统发育和物种分化的分子标记。 线粒体DNA分子结构简单稳定,基因排列紧凑,为严格的母系遗传,几乎不 发生重组,即便发生重组也不产生新的线粒体基因DNA基因型。细胞色素b是构 成线粒体氧化磷酸化系统复合体III的蛋白质之一,也是由线粒体基因组编码的蛋 白质之一351。由于线粒体细胞色素b基因进化速度较快,故适合种群和种间水 平的差异的检测‘361。并且线粒体细胞色素b基因序列易于用一些通用引物扩增 和测序,应用广泛,研究资料较多,便于比较分析。 S7核糖体蛋白质基因是由一系列的外显子和内含子相互串联而成的不连续 的蛋白质编码基因f37】。内含子承受的进化压力小于相应的外显子,较外显子序 列具有更明显的遗传多态现象,可能提供丰富的进化信息。鱼类S7核糖体蛋白 质基因包括7个外显子和6个内含子,其中内含子1序列长度比较适中而易得到 全序列。研究表明,S7核糖体蛋白基因内含子l作为遗传标记在鲤科系统发育 研究中的分辨率较高【38】。 2.2实验主要器材 BiometraTI Thermocycler:Biometra公司 14 。娄只蓉硕lj学位论文 DYY.III.5型稳压稳流电泳仪:北京六~仪器厂 GDS8000凝胶成像系统:UVP公司 C铋确凡ge 541 7R冷冻离心机:Eppendorf公 LX一100手掌型离心机:江苏海门市麒麟医用仪器厂 QL一901微型漩涡混合器:江苏海门市麒麟医用仪器厂 GNP-9080BS.III隔水式恒温培养箱:上海新苗医疗器械制造有限公司 2.3实验主要药品及溶液配制 本实验使用的主要试剂: 蛋白酶K(Merk公司;lOmga);琼脂糖(BIOASIS公司);TaqDNA聚合 酶(Biostar公司;2U/u1);Taq酶缓冲液(Biostar公司:500mMKCl,100mMTris C1, PH8.3,15mMMgCl2);dNTPs(101nM):双蒸水(ddH20);十二烷基硫酸钠(SDS): 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na 2H20);NaCI;Tris碱;氯仿;异丙醇;冰 乙醇;无水乙醇;70%乙醇;溴化乙锭(EB)。 实验主要的溶液配制【39】: (1)HOM Buffer: 含有终浓度为80mMEDTA、100mMtris碱和0.5%SDS。 (2)0.5mol/L的EDTA(pH8.o): 800mldd H20+186.19EDTA,在磁力搅拌器上剧烈搅拌,加NaOH调节pH 至8.0(约需209NaOH颗粒),加ddH20定容至1L。高压灭菌。 moi/LTris’CI:800mlddH20+121。lgTris碱+42ml浓HCl调节pH-至-8.0,力llddH20定容至 1L。高压灭菌。 (4)10%SDS: 900mlddH20+1009SDS,加热至68促溶,(加几滴浓盐酸调节pH-_至7.2) JJfldd H20定容至1L。无需灭菌。 (5)STE缓冲液(pH8.0): 含有终浓度为0.1mmol/LNaCl、10mmol/LTris C1和lmmol/LEDTA。 (6)氯仿:异戊醇--24:1 (7)50x电泳缓冲液(50xTAE缓冲液,甚l/Tris一乙酸缓冲液): 15 厶量鼻;硕士学位论文 2429"Iris碱"-1-57.1ml冰乙酸+1 00ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),加ddH20定容 至1L。高压灭菌。 (8)NaCl(4.5M):终浓度为4.5mol/L。 (9)蛋白酶K: 100mg蛋白酶K溶于10ml灭菌的双蒸水中,使保存浓度为10mg/ml,以lml 分装,.20"C冷冻保存。 2.4基因组DNA的提取 本实验采用了两种提取DNA的方法,一种为高盐浓度抽提法,另一种为 常规的酚一氯仿抽提法。现将两种方法分别介绍如下。 酚.氯仿抽提法: 本方法参照Kocher等并略有改动[401。 基因组DNA的提取步骤: (1)取材、浸泡:取95%酒精浸泡的鱼体标本肌肉约30—50mgj:1.5ml Eppendo艚中,尽量剪碎,恒温培养箱中烘至无酒精味。 (2)消化:加入600山细胞裂解液(STE,pH8.0),601.tl10%SDS(终浓度为 1%),lOlal蛋白酶K(终浓度为100--2001.tg/m1),轻轻振荡混匀后放在恒温培 养箱内56消化至透明(其间要常振荡)。 (3)抽提步骤1:加入等体积平衡酚(约700p1),混匀30分钟,13000r/min离 ,t二lO分钟,取上清液。 (4)抽提步骤2:加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混合液,混匀30分钟, 13000r/min离,LIO分钟,取上清液。如果中间还有白色蛋白层,重复抽提步骤1、 2,直至没有白色蛋白层。 (5)沉淀:在上清液中加入约两倍体积的冰无水乙醇,于-20。C沉淀至少1小时, 13000r/min离-L15分钟,弃上清液,并小心防止DNA沉淀块倒出。 (6)漂洗:加入5001al的75%冰乙醇,混匀漂洗以除去残余的盐,13000r/min 离心2分钟,取上清液。如果杂质较多,可以重复该步骤几次。 (7)干燥:将管倒立于卷纸上,室温下干燥DNA沉淀块,除去残余乙醇。 (8)溶解:加入100一200pl灭菌水溶解DNA沉淀。将溶液分为2份,一份4"C备 用,一份.20保存。 16 羹只客硕L学位论文 (9)电泳检测DNA:根据所需浓度称约0.89的琼脂糖,]HXIOOml 1xTAE电泳 缓冲液;微波炉加热使琼脂糖溶解;溶液约冷至60,加入溴化乙锭至终浓度为 0.51ag/ml;将琼脂糖溶液倒入模具,迅速在模具上一端安插上梳子,凝胶厚度一 般为0.3—0.5cm;室温下待琼脂糖溶液完全凝固,然后取出梳子,将凝胶放置于 电泳槽中;加入1xTAE电泳缓冲液至液面高于胶面约Imm;在上样膜上点上样缓 冲液(溴酚蓝染料;约DNA样品的六分之一),再将DNA样品各3—4功口入到 上样缓冲液中,混匀;将DNA样品注入加样孔, 100一120伏电泳30分钟。电泳 完毕后将凝胶置于紫外凝胶成像系统中观察拍照。 高盐浓度抽提法: 这是一种既简单,效果也比较好的改进的基因组DNA提取方法。本方法参照 AljanabiSM,并略作改动【411。 基因组DNA的提取步骤: (1)取材、烘干:取95%酒精浸泡的鱼体肌肉30—50mg于2mlEppendo艚中, 尽量剪碎,置于烘箱中烘干至无酒精味。 (2)消化:}JI]/N.5009l HOM Buffer和10--159l蛋白酶K,轻轻混匀后置于恒温 培养箱内55消化至透明; (3)抽提:加入5009lNaCl(4.5M),3001al氯仿,轻轻混匀15分钟。以10000r/min 离一I二10分钟,用剪头的lml枪头将上清液转移至另一离心管中(约85091)。 (4)沉淀DNA:JJ[1K5951al的异丙醇(上清液的0.7倍体积),混匀,置于.20。C 下至少-d时。 13000r/min离心10分钟,弃上清液。加5009l70%的乙醇洗涤2次,4"C9000r/min离心5分钟,弃上清液(为防止DNA沉淀块倒出,此 步要小心操作)。 (6)干燥、溶解:同前。 (7)电泳检测DNA:同前。 2.5PCR扩增和测序 扩增线粒体细胞色素b基因所用引物为:L14724(5’.GAC TTGAAAAAC CACCGT TG-3’)和H15915(5'-CTC CGATCTCCGATTACAAGA C一3’);扩增 s7核糖体蛋白内含子1所用引物为:Ll(5'-TGGCCTCTTCCTTGGCCGTC.3’1) 17 of片g硕士学位论文 和RI(5’.AACTCGTCTGGC1]厂rTCGCC-3’)。 PCR反应体系约60ul,其中灭菌双蒸水46.5ul,10x Taq缓冲液6u1,正反 向引物各1.5ul,dNTPso.75ul,Taq酶0.9ul;模板加1—3lll。 线粒体细胞色素b基因的扩增程序为:94预变性3min;第二步94 变性30sec;54-58"c退火45see;72延伸Imin;重复至35次; 72延伸8min。 S7核糖体蛋白基因内含子1的扩增程序为:0)94"c预变性3min;第二步 94变性30sec;54.58"C退火45see;72延伸lmin40sec;重复至35 次;72延伸8min。 扩增后用0,8%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 扩增产物的纯化、回收和测序由测序公司完成。 2.6数据的处理和分析 得到的序列利用ClustalXt42】软件对序列进行排定并参照测序的峰形图利用 SEAVIEWl43】程序对序列进行人工核对,删除序列开始和末尾测序信号较差的碱 利用软件DNAsp4.10.9分析吻绚属鱼类的遗传多样性,包括核苷酸多样性(Nucleotide Diversity简称冗)和单倍型多样性(HaplotypeDiversity简称h) 144A5] 利用MEGA2.It删软件分析序列中各碱基的含量、变异情况和转换颠换值;并用该软件作NJ(Neighbor-joining)系统发育树,分析吻】蠹句属鱼类的系统发育。 基于线粒体细胞色素b基因序列构建的NJ树以绚亚科的麦穗鱼(Pseudorasbora parva)和铜鱼(Coreiusheterodon)为外类群。基于S7核糖体蛋白基因内含子l 序列构建的NJ树以铜鱼为外类群。 使用ARLEQUIN Version3.0软件分别对三物种作歧点分布分析以及 Tajima’SD和Fu’S Fs中性检验,用DNAsp4.10.9做歧点分布图,以对三物种的 动态历史有个全面了解144471。 3结果 3.1线粒体细胞色素b基因序列碱基组成及遗传多样性 实验共获得长1111bp的线粒体细胞色素b基因序列片段260条,T、C、A、 18 Z茹只孥硕卜学位论文 G碱基平均含量分别为29.1%、28.2%、28.6%、14.1%,A+T的含量明显高于C+G的含量。序列中平均发生转换的频率是颠换的6.4倍。1111个位点中,保守 位点891个,变异位点220个,其中简约信息位点173个。 260条长111lbp的线粒体细胞色素b序列片段检测到单倍型113个。其中, 83条吻觞的细胞色素b序列(其中两条序列来自宜宾的两尾编号为YYl和YY2 的圆筒吻觞)检测到42个单倍型,70条圆筒吻绚的细胞色素b序列检测到28 个单倍型,107条长鳍吻绚的细胞色素b序列检测到43个单倍型。值得注意的 是,宜宾圆筒吻觞YY2和19尾吻觞共享单倍型BWl;宜宾圆筒吻绚YYl和5 尾吻觞共享单倍型BW2。 吻纳、圆筒吻绚和长鳍吻绚基于线粒体细胞色素b基因序列的核苷酸多样性 和单倍型多样性见表3。可见三种鱼都是单倍型多样度较高而核苷酸多样性较